التكنولوجيا الحيوية

التصميم التجريبي : Experimental Design

يعتبر التصميم التجريبي من أهم خطوات مشروع بحث الانظمة البيولوجية الاداة الثالثة وذلك

لمبررات عديدة منها:

أولا :يعتبر التخطيط التجريبي المناسب ضروريا للتركيز علي البحث واستخدام مصادر فعالة .حيث نحتاج الي نقاط وقت مضاعفة لجمع بيانات عن التراكيب المظهرية العديدة .فعلي سبيل المثال:

نقاط الوقت المبكرة ربما تكون أكثر معلوماتيه لقياس التنظيم النسخي tranxcriptional regulationالمباشر )مثل :استخدام نواسخ transcriptomicاو استخدام كروماتين الترسيب المناعي chromatin immunoprecipitationبالتزاوج مع تسلسل الحامض النووي DNA العالي الكثافة .ومن جهة اخري فإن نقاط الوقت المتأخرة تكون اكثر معلوماتيه في تقييم انتاج البروتين او في التغيرات التي تحدث في عملية التمثيل الغذائي ثانيا :استخدام ظروف مضاعفة يجب اختيارها حتي نستطيع تقدير وتقييم مظهر التنظيم علي نطاق اكبر وأوسع .والعمل الناتج من أنظمة نموذجية مثل الخميرة حيث يتواجد خطوط حاسمة لكل ٦٧٠٠جين خميرة يوضح لنا ان تحليل النواسخ لجميع الخطوط يسمح للحاسب الآلي اظهار

علاقات بيولوجية جديدة للعمليات التنظيمية.

ثالثا :تكرار العينة ضروريا ليكون للدراسة قوة احصائية كافية لاظهار فروق بيولوجية هامة بين المعاملات وفي النهاية يجب ان تتحكم الخطة التجريبية في جميع المتغيرات الخارجية حتي لا تنسب أي تغيرات غير غامضة للمعاملة موضع الاهتمام.

الخريطة الجينية والتقدم الجيني : Genetic Mapping And Forward Genetic الوراثة المتقدمة وقياس التركيب المظهري ثم بعد ذلك تقدير الارتباطات مع التباينات في التركيب الوراثي تعتبر وسيلة هامة لدراسة تمثيل ووظيفة المركبات الغذائية .والفكرة الأساسية لهذه الطريقة تبدأ مع حقيقة ان التباينات الطبيعية للتسلسل تظهر داخل الجينوم .ويعتبر هذا التباين وراثيا والمفيد في الوراثة المتقدمة ان هذه التباينات الوراثية يجب ان تؤثر علي التراكيب المظهرية ،وعلي سبيل المثال :مستويات العناصر المعدنية بالأنسجة او معدل اكسدة الاحماض الدهنية.

وفي النهاية بخلاف ذلك فإن الطفرات النادرة التي تشكل اساس الأمراض الوراثية العديدة والتي تسبب تراكيب مظهرية نهائية علي سبيل المثال :طفرات في النحاس الناقل لانزيمات مركب الطاقة ATPالمسئولة عن مرض Menkesكما ان التغيرات المظهرية الناتجه من التباين الطبيعي المتعرف عليها بواسطة الوراثة المتقدمة تعتبر غير مميته ولكن ينتج عنها فروق شديدة بين الأفراد المستقلة ،والهدف هو استخدام تباينات في التراكيب المظهرية التي تنتج من استراتيجيات التربية المحكمة او من خلال انساب pedigreesلرسم خريطة لموضع التباين الوراثي الطبيعي الذي يتحكم في التركيب المظهري وطريقة الوراثة المتقدمة لا تقدم أي افتراضات عن الجينات التي تؤثر علي الصفة ،ولكنها تسمح بتباينات في التركيب المظهري المباشرة لنا الي مناطق الجينوم المحتوية

علي متنوعات وراثية لها تأثير بيولوجي معنوي.

ومن جهة اخري يستفاد من الوراثة المتقدمة في الحالات التي لا نستطيع من خلال المعرفة الكافية عن تمثيل مركب غذائي لتبرير عمل جين حاسم او نقل جين في الفئران او عندما يكون للفئران حيوية طبيعية مستمرة عند اكتشاف جين مرشح .candidate ويتم ارتباط التراكيب المظهرية الهامة المتعلقة بالتغذية بالتباين الطبيعي من خلال مسارين هما الخريطة الجينية والاربتاط الجيني .ولقد استخدم التحليل المتواصل داخل العائلات الكبير وموضع

١٣٢

الصفة الكمية QTLفي الهجن المحكمة بين خطوط التربية الداخلية للفئران لتصحيح التباين في

تركيب مظهري الي تباينات متسلسلة في الجينيوم.

علم الوراثة المتقدمة لصالح التغذية تم تقييمه حديثا علي تمثيل عنصر الحديد حيث رسمت الجينات المتحكمة في %٣٠من التباين في مستويات حديد الطحال بين الخطوط الوراثية للفئران المرباه داخليا الي كروموسوم ٩٠وداخل هذا الموقع تم مطابقة التباين في جين Mon laواستخدمت هذه المعلومة لتحديد كون هذا الجين مكون هام لتمثيل حديد الطحال واعادة دورة حديد كرات الدم الحمراء داخل خلايا macrophagesوبالتالي فإن الوراثة المتقدمة تسمح للباحثين باضافة جزئية

اخري لهذه الصورة المعقدة.

مدي أهمية وصحة النتائج المتحصل عليها من أدوات الاوميك عاليه الكثافة:

How Important Is Validation Of Results From High Density Omic Tools :

يجب ان تكون التجربة المتعلقة بالاوميكس omicsقوية وموجودة منها نسخ منشورة بحثيا ومن الممارسة القياسية التأكيد علي التغيرات في تحت مجموعة نسخ التعبير المميزة او البروتينات مع الأدوات التقليدية وهذا يوجد ثقة في جودة النتائج المستخلصة من برنامج الأوميك.

التكلفة المتزنة والمحتوي : Blancing Cost And Content من زمن مضي كانت تكلفة الجمع المثالي للبيانات من تجارب الانظمة البيولوجية عالية وكان الوقت ودراسة استجابة الجرعة في الخلايا والحيوانات او الانسان ليست بعيدة عن الطبيعي ،وتكلفة استخدام ادوات "اوميك" عديدة وخاصة علي العديد من الانسجة اصبحت ضخمة ولهذا السبب استخدم العلماء استراتيجتين من اجل احتواء التكلفة ففي الاستراتيجية الأولي يركز الباحثون علي اداة "اوميك" واحدة لها أهمية بالموضع الذي يتعلق بتساؤلهم البيولوجي والباحثون لفيتامين Aأو D ربما يفحصون ال Transcriptomeبسبب تفهمهم الجيد بأن للنواتج التمثيلية لهذه المركبات تعتبر منظمات مباشرة للتعبير الجيني .كما أن الباحثين لتأثير الأحماض الأمينيه ذات السلسلة المتفرعة علي الأداء الطبيعي ربما يدرسون بروتيوم proteomeالعضلات بسبب التاثير البنائي anabolic المعدل عن طريق اشارات m TORعند مستوي البروتين .وباحثون اخرون ربما يختبرون ميتابولوم metabolomeالسيرم بعد التغذية علي علائق تحتوي علي مستويات مختلفة من المركبات الغذائية الكبري وفي الاستراتيجية الثانية .لا يحدث تقليل لتكلفة التجارب ولان توزع التكلفة عبر مجموعات بحثية كثيرة وفي هذه الحالة يعمل الباحثون كفريق وليس كل علي حدة في المعمل ويأخذ كل عضو في الفريق مسئولية مسألة واحدة في النظام حيث يكون اهتمامهم وخبرتهم اكبر في

هذه المسألة.

مطابقة التغيرات المعنوية في نظام بعد الاضطراب:

Identifying Significant Changes In A System After Perturbation :

يعتبر التحليل الاحصائي احد الأمور غير المعتمد قيمة للأنظمة البيولوجية ومدي اهمية التحليل الاحصائي للتجارب والنواحي الأخري للأنظمة البيولوجية .أولا :عند غياب الاحصاء لا يستطيع الباحث تقييم واقعية كل من الفروق الملحوظة بين مجموعات المعاملات التجريبية ،ارتباط التباين الوراثي مع التراكيب المظهرية السائدة ،أو اغناء مسارات معينه او شبكة عمل منظمة بعد معاملة وعندما تكون التغيرات الكبيرة ذات أهمية بيولوجية تصبح مجموعة التغيرات الصغيرة في مستويات النسخ لكثير من مكونات المسار او العملية البيولوجية هامة ايضا .ثانيا :استخدام اختبار t.test مع مستوي معنويه p p0.5لا يكون كافيا لاختيار المعنوية الاحصائية لانه يتجاهل أهمية معدلات خطأ النمط ) type Iايجابيات خاطئه( ومن جهة أخري فإن طرق التصحيح الاحصائية مثل ) Bonferroniقيمة أ/عدد المقارنات علي سبيل المثال (٦-١٠ ×٢.٥ = ٢٠٠٠٠/٠.٥تعتبر

١٣٣

قديمة جدا لانها تؤدي الي معدل خطأ عالي للنمط ) type IIخطأ سلبي( ونتيجة لذلك طور علماء الاحصاء طرقا مثل طريقة معدل اكتشاف الخطأ FDRلاتزان النمط typesومشاكل معدل خطأ النمط type IIوذلك عند عمل مقارنات مستقلة عديدة وهناك طريقة اخري لتقليل مشكلة المقارنة المتعددة حيث يستبعد فيها الصخب في اجراء الاكتشاف .فعلي سبيل المثال بالرغم من قدرة الانظمة الدقيقة علي قياس ..جميع النسخ transcriptالمعبرة في جسم الانسان فان بعضا من هذه النسخ يعبر عنها في كل خلية او نسيج .وبإزالة النسخ من مجموعة البيانات يمكن تقليل عدد المقارنات المستقلة وتقليل مشكلة المقارنات المستقلة التي تسبب معدلات خطأ عاليه للنمط type Iوزيادة القدرة علي اكتشاف الفروق بين مجاميع المعاملات.

في النهاية تتحسن القدرة علي اكتشاف الفروق المعنوية عن طريق مكررات العينة ويفيد هذا التكرار في حالة التباين البيولوجي في البروتين ونواتج التمثيل الغذائي او عندما يكون مستوي

النسخة عاليا.

النماذج الحسابية للعمليات التمثيليه والفسيولوجية:

Mathematical Modeling Of Metabolic And Physiologic Process :

يمكن تمثيل العلاقة بين المتغيرات في النظام البيولوجيا كنموذج حسابي وهذا ما نعمله عندما نرسم رسما بيانيا لاستجابة الجرعة حيث يعبر عن العلاقة بين الجرعة والناتج كخط انحدار ...وكلما زادت صعوبة النظام كلما كانت العلاقات البيانية البسيطة بين المقياسين غير وافية لتوضيح البيولوجيا .وتحت هذه الظروف يمكن استخدام حسابات للمشاهدات التجريبية لخلق نموذج مبسط للنظام .وهذه الطريقة تكون ذات ديناميكية عند تمثيل المركبات الغذائية )مثل :تمثيل الكالسيوم( ولقد حاول الباحث lee Baldwinتطويرنماذج تنبؤية لكيفية تنظيم التغذية لتمثيل الطاقة واداء

الحيوانات المجترة.

من أمثلة النماذج الحسابية الفعالة نوعية وعمق البيانات المتاحة لبناء النماذج .ومع التقدم الظاهر في توليد بياناتنا نتيجة لحقبة الأوميكس بدأ الباحثون يعتقدون ان نمذجة الأنظمة البيولوجية تكون ممكنه وعلي العكس تماما يصعب تطوير النماذج الكمية ونتيجة لذلك فإن اول خطوة في العملية هي اخذ المعرفة التجريبية الموجودة واستخدامها في بناء نموذج خام ،ويتحسن هذاالنموذج الخام

باجراء تجارب اضافية.

قوة قاعدة البيانات المنشورة : The Power Of Public Database تكلفة اجراء تجربة انظمة بيولوجية باستخدام ادوات الاوميكس omicsيمكن جعلها متوسطة لكثير من الباحثين .والبديل لاجراء تجارب اولية هو اعادة تحليل التجارب المتاحه في قواعد البيانات المنشورة .وفي جدول ) (١٦العديد من قواعد البيانات المفيدة وعلي سبيل المثال :اعادة تخزين لقواعد بيانات المتعلقة بالمادة الوراثية والنسخ هي تعبير جيني Gene expression Ominbus ) (GEOعند NCBIولقد طابق بحث لحامض الفوليك ٧قواعد بيانات و ٣٤سلسلة بيانات بالاضافة الي ذلك ربما يكون هناك تعهد جوهري للباحثين لتعلم كيفية استخدام ادوات المعلوماتيه البيولوجية التي تسمح للباحث عمل اد ارك او احساس لهذه القواعد البياناتية ومن جهة اخري فإن تحليل هذه القواعد البياناتيه ربما تسمح لباحث توليد بيانات تمهيدية لبحث اضافي او كبيانات

تمهيدية لتطبيق مسلم به.

توحيد انماط البيانات : Integration Of Data Types الهدف من الأنظمة البيولوجية هو توليد نموذج تنبؤي للنظام .ومعظم الباحثين يعملون مع نمط واحد من البيانات )وعلي سبيل المثال الميتابولوم او الترانس كريبتوم( ولكن مثاليا تستخدم جميع

١٣٤

انماط البيانات في وقت واحد .وهذا لا يتضمن فقط انماط بيانات الاوميكس المتنوعة ولكنه ايضا يتضمن بيانات تحليلية علي المرضي وبيانات تخيل من العينات البيولوجية وغيرها وكل خطوه في مكونات التحليل الاساسية تحاول تفسير الكثير من التغير والتباين في البيانات بقدر الامكان ولقد استخدم الباحثون PCAلتوحيد المعلومات المتعلقة بالأنماط الجينية المرتبطة بالحديد لاستخدامها في تحليل QTLووجدوا ان توليفة من الهيموجلوبين والمكونات الخلوية والحديد الكلي بالبلازما

كانت أكثر فائدة mappingمن الصفات المستقلة.

جدول ) (١٧قطاع لأدوات تحليل البيانات المتاحة المنشورة للأنظمة البيولوجية

Description

Open source and open development software project for the analysis and comprehension of omic data

(based on R programming language).

Excel-based tool for statistical analysis of omic data.

Website

www.bioconductor.org/

Name

Bioconductor

www-stat.stanford.

edu/∼tibs/SAM/

Signifi

cance

Analysis

of

Microarrays

)(SAM

GenePattern

www.broad.mit.edu/

tools/software.html

www.broad.mit.edu/

tools/software.html

A genomic analysis platform with access to more

than 125 tools for analysis of omic data.

Gene Set

A computational method that determines if a set of

Enrichment

genes with a

)Analysis (GSEA

common function (e.g. lipid metabolism) are signifi

cantly altered

by treatment/condition.

GenMAPP

www.GenMAPP.org

Tool for visualizing omic data on maps representing

biological pathways and groupings of genes.

Statistical analysis for nrichment of changes in maps

can be determined.

Cytoscape

www.cytoscape.org/

Tool for conducting network analysis and visualizing

the results.

a

See Gehlenborg et al. (2010) for a comprehensive list of various omic analysis tools.

استخدام الطرق الاحصائية التي تدمج المعرفة السابقة داخل التحليل:

Application of statical approaches that incorporate prior knowledge

into the analysis :

هناك مسائل عديدة تحد من الاستفادة من الطرق الاحصائية التقليدية عند استخدامها في بحوث الانظمة البيولوجية فعلي سبيل المثال :معدلات الاكتشاف الايجابية الخاطئة العالية بسبب مشكلة المقارنة المتعددة ،انتهاك افتراض الاستقلال بين المرقمات الجينية ،عدم المقدرة علي ادماج المتغيرات البيئية ،الصفات المرتبطه داخل النماذج والتحليل ومن جهة اخري نظ ار لان معظم الباحثين يتعلمون الاحصاء من منظور التكرار frequentist perspectiveفان طرق التحليل من منظور Bayesianسوف تتطلب تدريبا اكثر .بالاضافة الي ذلك هناك برامج اقل لاحصاء Bayesianوتعتبر المتطلبات الحسابية لاحصاء Bayesianعائقا لمعظم علماءالبيولوجيا.

الفينولات العديدة بالقهوة وسرطان الصدر : Coffee polyphenols and breast cancer وجد ان القهوة من أكثر المشروبات الشعبية المفضلة في كل دول العالم وحديثا اظهرت الارتباطات العكسية بين المتناول من القهوة وخطورة سرطان القولون والكبد والصدر ولقد لوحظ بحثيا ان استهلاك فنجان قهوة يوميا يقلل بنسبة %٤٩من خطورة سرطان الجزء العلوي من المعدة والأمعاء

١٣٥

في العشيرة اليابانيه بينما لوحظ في دراسات اخري ان الرجال الذين يشربون بانتظام القهوة تقل خطورة اصابتهم بسرطان البروستاتا وذلك عندما يقل محتوي القهوة من الكافين.

الارتباط العكسي بين المتناول في القهوة وسرطان القولون يمكن تفسيره بوجود المركبات الفينولية في القهوة وفيما بين طريق المركبات الفينولية المختلفة في القهوة تعتبر احماض hydroxyconnamicمن اكثر هذه المركبات تواجدا وتظهرفي صورة استر -وتعتبر القهوة المصدر الرئيسي لحامض 5-caffeoylquinic Chlorogenicفي وجبه الانسان ويتراوح المتناول اليومي من مشروب القهوة من ٠.٥الي ١جرام .ولقد اظهرت الدراسات ان %٣٣من المتناول من حامض Chlorogenicو %٩٥من حامض Caffeicيمتص بالأمعاء وبالتالي يصل ثلثي المتناول من حامض chlorogenإلي القولون حيث يتم تمثيلها الي حامض .caffeic باستخدام transcriptomicsيكون تأثير المستوي الجزيئي للمركب الفينولي في القهوة )حامض (Caffeicمعادلا لفنجان قهوة علي الخلايا السرطانيه بقولون الانسان وعلاوة علي ذلك تم تقييم

تأثير فينولات القهوة في خلايا سرطان الصدر.

عند تحضين خلايا adenocarcinoma HT29بالقولون مع حامض Caffeicعند تركيز معادل لفنجان قهوة لمدة ٢٤ساعة لوحظ ان هذا التركيز لم يسبب أي تأثيرات سامة للخلية في تحضينات الخلية وعندئذ حلل التعبير الجيني بواسطة التهجين بجينوم الانسان ٢ + U133 A نظام دقيق من Affymetrixالمحتوي علي ٤٧٠٠٠نسخه متنوعة.

عند التحضين مع حامض caffeicعبر عن ١٢جين فكانت عاليه التعبير بينما كان ٣٢جين منخفضة التعبير ،وفيما بين الجينات العالية التعبير كان %٣٣تخص عوامل النسخ %٢٥ ،تخص دورة الخلية و %١٧تخص عمليات التخليق البيولوجي او استجابة المناعة .وباستخدام هذه البيانات انشئت ) Biological Association Network (BANباستخدام مسارالتحليل خلال جين Gene Springومن جهة اخري فإن ناقل الإشارات signal transducerومنشط نسخ 5B STAT5Bوعامل النسخ النشط 2 ATF – 2ظهرت كعقد متصلة داخليا.

أكدت التغيرات في تعبير الحامض النووي m RNAللعقدتين الرئيسيتين STYAT 5B and ATF- ) (2بواسطة Rt-PCRوعند مستوي بروتين بواسطة تحليل ) westernblotشكل (٦والوظيفة الرئيسية ل STAT5bهي تعديل تاثيرات هرمون النمولأن STAT5B-nullللفئران فشلت في

الاستجابة بفاعلية لهذاالهرمون.

١٣٦

Biological Association Network (BAN) of differentially expressed genes under caffeic treatment. The BAN was constructed with the Pathway Analysis software within GeneSpring v11.5.1. An expanded network was constructed by setting an advanced filter that included the categories of binding, expression, metabolism, promoter binding, protein modification and regulation. Only proteins are represented. The BAN shows the node genes STAT5B and ATF-2 that were

further studied.

HT29 ومستويات البروتين فى الخلاياmRNA ( كمية حمض٧) شكل

١٣٨

Quantification of mRNA and protein levels for STAT5B and ATF-2 in HT29 cells. The mRNA levels of STATB5 (A) and ATF-2 (B) were determined in control HT29 cells (empty bars) and cells treated with caffeic acid (CA, filled bars) by RTReal Time. Results are expressed in fold-changes compared to the control, and are the mean + SE of 3 different experiments. *p<0.05 compared with the corresponding control. The protein levels of STAT5B (C) and ATF-2 (D) were determined in control HT29 cells (empty bars) and cells treated with caffeic acid (CA, filled bars) by Western blot. Blots were reprobed with an antibody against βactin or tubulin to normalize the results. Results represent the mean ± SE of 3 different experiments.

*p<0.05 and **p<0.01 compared with the corresponding control.

ولقد وصف تعديل مستويات STAT5أو النشاط النسخي في الخلايا المعاملة مع المركبات الطبيعية مثل فلانوتويد flavonoidالليمون flavins, silibinics ،بيولوجيا لل silymarin المعزول من silybum marianumولوحظ ان تنشيط Stat5 Bفي سرطان صدر الانسان ينظم النسخ لجينات E2 sensitiveوالتي من امثلتها Cyclin Di and C-Mycيلعب دور في نمو سرطان الصدر E2-stimulatedكما ان تنشيط Stat5له صلة بتنظيم تعبير دورة الخلية

والتحكم في .protein cyclin D1

يعتبر ATF-2عضو للبروتين المرتبط بعنصر الاستجابة (CREB) ATF-CAMPلعائلة عوامل النسخ التي ترتبط بعنصر الاستجابة CAMPالموجود في منشطات جين الثدييات ويظهر ATF-2وظائف مخمدة للورم الخبيث tumorويتواجد CREXفي جينات عديدة تستخدم في التحكم في دورة الخلية كماأن جين ATF-2 , cyclin DLالمرتبط بهذا التسلسل ينبه نسخ cyclin DIبالاضافة الي ارتباط AFT-2مع التوالد proliferationالغزو ،الهجرة ومقاومة العوامل المتلفة للحامض النووي DNAفي خطوط خلية سرطان الصدر.

العقدتان الرئيسيتان المطابقة تنظم نسخ cycline Diكما يعتبر cyclin DIمنظم هام لمرحلة التحول وتعبيره في خلايا سرطان الصدر يعتبر حساس للأستيروجينات مضادات الاستيروجينات.

يعبر عن cyclin D1عند مستوي البروتين والحامض النووي m RNAفي أكثر من ٥٠من سرطانات الصدر اما في وجود او غياب تضخيم الجين وهو من أكثر البروتينات تعبي ار في سرطان الصدر .وكما هو واضح في الشكل التالى فإن تحضين خلايا MCR-7مع حامض الكافيك caffeicادي الي انخفاض شديد في مستويات بروتين Cyclin D1مع زيادة مستويات

STAT5bوعدم انخفاض في مستويات .AFT-2

١٣٩

شكل ) (٨تعبير CuclinDlعند التحضين مع حمض كافيك فى خلايا MCF-7 Expression of cyclin D1 upon incubation with caffeic acid in MCF-7 cells. The protein levels were determined in control MCF-7 cells (CNT) and in cells treated with caffeic acid (CA) by Western blot. Blots were reprobed with an antibody against β-actin to normalize the results. Results represent the mean ± SE of 3 different experiments. *p<0.05 and ***p<0.001 compared with the corresponding

control.

يعتقد ان تلك المركبات التي تعدل من تعبير cyclin D1لها دور في منع وعلاج الأورام الخبيثة neoplasiaوعلي سبيل المثال فان مركب الفلافونويد المخلق والمستخلص من نبات هندي يستخدم في علاج السرطان محدثا انخفاضا سريعا في مستويات بروتين cyclin D1ومن ثم فانه خلال النتائج السابقة كلها يعتبر تثبيط تعبير Cyclin D1طريقة جيدة لعلاج السرطان كماان القهوة وحامض الكافيك قادرتان علي تقليل تعبير cyclineفي خلايا سرطان الصدر مما يقترح بأن بعض مكونات القهوة يمكن استخدامها كأداة علاجية.

الفينولات العديدة بالكاكاو والتغيرات في التعبير الجيني CYPIAIحيث الكاكاو غني في الفينولات وفي الحقيقة محتوي الكاكاو عالي من الفلافانول flavanolمقارنه بجميع الاغذية الاخري .ومن تحت صفوف ال Flavonoidsالموجوده في الكاكاو catechin and oligomersوهناك فوائد صحية كثيرة عند تناول مشروب الكاكاو .أظهرت الدراسات التي اجريت علي المتناول من الكاكاو انه ينشط ويساعد العوامل في تقدم السرطان وخاصة مرقمات مضادات الأكسدة علاوة علي ذلك هناك دليل علي ان الفينولات العديدة تلعب دور في تنظيم apoptosisبالاضافة الي ذلك فإن الفلافانولات Flavanolsالموجودة في الكاكاو تظهر تأثيرات proapoptoticومن جهة اخري فان

١٤٠

Proanthocyanadinsتمنع نمو خلايا سرطان رئة الانسان ،كما ان epicatechinتعزز apoptosis في خلايا سرطان الرئة المعاملة epigallocatechin – 3- gallate LEGcGولقد لوحظ ان الفينولات العديدة بالكاكاو تمنع نشاط المركبات المسببة للطفرة mutagenicللأمينات الحلقية.

أوضحت الدراسات ان catechinsالمستخلص من الشاي الاخضر لها فاعلية في تعديل الاستيروجين المحدث لسرطان الصدر اما بالتداخل مع مستقبل المسارات المعدلة او تقليل نواتج تمثيل الاستيروجين الجينية السامة .ولقد تم تقييم تأثير مركبات flavonoidsالكاكاو في خلايا سرطان الصدر في دراسات بحثية عديدة ومن جهة اخري كان للأستيروجين دور في استهلاك وتنشيط سرطان الصدر ،وتعرض فترة حياة الاستروجين تعتبر عامل المخاطرة الرئيسي لسرطان

الصدر.

تبدي الاستروجيات تأثيراتها المسببة للسرطان carcinogenicبواسطة كل من مستقبل الاستيروجين ERوالميكانيكيات المستقلة وتعتبر سرطانات الصدر في الانسان ايجابية ل ERويمكن تنبيه نموها بواسطة الاستيروجين ومنعها بواسطة مضادات الاستيروجينات التي من أمثلتها tamoxifen لهذاالغرض حضنت خلايا MCF-7لمدة ٢٤ساعة مع مستخلص فينولات الكاكاو النقية PCE ولقد استخدم هذا المستخلص كممثل ل Flavonoid monomers & oligomersالموجوده في الكاكاو ولم تكن التركيزات المستخدمة سامة واجري تحليل التعبير الجيني المميز باستخدام انظمة PCRولقد لوحظ أن التعرض ل PCEقلل من تعبير Serpine 1وتعبير جينات CYPIAI,GADD45 A, GDF15, GPX1, TP53 and XRCE 2كما هو واضح في

الجدول التالي.

فيما بين هذه الجينات اختير CypIAIللأسباب التاليه منها انه يعتبر احد الجينات الأكثر تعبي ار عند التحصين مع PCEتعبيره العالي يستجيب للفينولات العديدة ،يلعب دو ار هاما في التمثيل الاوكسيدي للأستيروجينات يعتبر CYPIAIجين مرشح للأختراق المنخفض لسرطان الصدر لأنه يلعب دور هام في تمثيل المواد المسببة للسرطان carcinogensوالتمثيل الاوكسيدي

للأستيروجينات.

جدول ) (١٨قائمة بالجينات تحت أو فائقة التعبير فى خلايا MCF-7بالتحضين مع PCE

لمدة ٢٤ساعة

MCF-7

Fold-up or down-regulation

P-value

Gene symbol

Test sample/control sample

CYP1A1

17.60

0.0001

GADD45A

4.20

0.0264

GDF15

2.60

0.0001

GPX1

4.25

0.0183

RAD23A

13.90

0.0394

SERPINE1

-49.90

0.0216

TP53

2.26

0.0470

XRCC2

17.50

0.0356

1The expression of each gene was reported as the fold change obtained after each treatment relative to control after normalization of the data. A cut-off of 2-fold was chosen since small changes in gene expression may represent important changes downstream those differentially expressed genes. Lists of differentially expressed genes, with a p-value<0.05, were generated from three independent

experiments.

بعض نواتج عملية التمثيل تكون اكثر نشاطا من الجزيئات الأولية وتسلك كمركبات مخية للشحنه السالبة electrophilicوبالتالي تنشط عمليات تكون الأورام الخبيثة tumorigenicبالاضافة الي

١٤١