البيئة وملوثات الأعلاف

البيئة وملوثات العلف

تأثير قيم AWعلى انتاج الميكوتوكسينات:

The Aw – value influences the production og mycotoxins.

حدود القيم Awفي انتاج الميكوتوكسينات من انواع من الفطريات

Mycotoxin

Penitrem A

Cyclopanzon acid

Grise ofulvin

قيم Aw-value

0.94

0.87

0.85

S – toxine

0.84

Ochratoxine

Aflatoxin

0.81

0.80

Aflatoxin

0.82

Ochratoxine

0.77

Penicillin acid

0.76

نوع الفطر Mould

Pencilium spec.

Pencillium

cyclopium

Aspergillus flavus

Aspergillus

parasiticus

Aspergillus

ochraceus

مسار السموم الفطرية داخل جسم الحيوان:

ويلاحظ ان لكل مجموعة سموم فطرية مسا ار خاص ا بداخل الجسم ،فقد وجد

اساسا على الجهاز الهضمي والكبد ،اما

ان مجموعة سموم الافلاتوكسينات تؤثر

مجموعة سموم اوك ار توكسينات فتؤثر على الجهاز البولى وخاصة الكليتين ،بينما ت ؤثر مجموع ة زيرالين ون عل ى الجه از التناس لى ب سبب احتوائه ا ع ل مركب ات الاستروجين ،اما سموم التريمورجينات فتؤثر على الجهاز العصبي.

وتدخل جميع ان واع السموم الفطرية الى الجسم من خلال الف م مع الغذاء المصاب ثم تتعرض لعمليات الهضم ثم الامتصاص ،وعند وصولها الى الكبد ءا منها ي رتبط بأنسجته ويتم توزيع جزء آخر على الاعضاء والانسجة

فان جز

المختلفة بالجسم ،جزء آخر مع الروث الى خارج الجسم ،بالإضافة الى خروج المنتج ات الحيواني ة )ل بن -ب يض( وبه ا اث ار م ن ه ذه ال سموم كطريق ة طبيعي ة

-١٤٨-

ملوثات العلف

للتخلص منها ،ويوضح الشكل التالى مسار السموم الفطرية داخل الجسم.

مسار السموم الفطرية داخل الجسم

سموم فطرية

لقناة الهضمية

الروث

الدم الوريدى البابى

الكبد

عصارة الصفراء

أنسجة العضلات

بيض أولين

الكلى

البول

-١٤٩-

العضلات

الدم الوريدى

البيئة وملوثات العلف

تقدير السموم الفطرية في العلف:

يمكن تقدير نوع وكمية السموم الفطرية في مواد العلف بالطرق الكيماوية او

البيولوجية او المناعية.

-١الطرق الكيماوية :Chemical methods

يتم تقدير السموم الفطرية في مواد العلف في المعمل بالاستخلاص بالمذيبات العضوية ثم يجرى فصلها من خلال جهاز كروماتوجراف الطبقات الرقيقة T.L.C او باستخدام كروماتوجراف العمود C.Lوحاليا يستخدم جهاز حديث للفصل يعرف ،High performance chromatographyويجب اجراء التقدير أكثر من مرة حيث يوجد تباين كبير عند تقدير السموم في نفس عينة العلف والتي ترجع الى اخطاء اخذ العينة نفسها او الا ختلاف في طرق الاستخلاص للسموم.

-٢الطرق البيولوجية :Biologicl methods

حيث يتم عمل مزارع للخلية او الانسجة ،بالإضافة الى اللجوء الى تجارب

الحيوانات مثل البكتريا واليرقات الحشرية.

-٣الطرق المناعية :Immunologyical methods

مثل اجراء اختبارات الترسيب واختبار اليس .Elistestوفى عام ١٩٩١قامت هيئة الاغذية الفيدرالية الامريكية يتقييم جميع الطرق المستخدمة في التقدير الكمى للافلاتوكسينات بغرض ايجاد طريقة اقل من طريقة الروكاتوجراف ذات الطبقة الدقيقة T.L.Cالمستخدم في ذلك الوقت على الذرة ،وتريد الهيئة التوسع في اجراء التقديرات على كل من حبوب الارز والقمح وفول الصويا وجلوتين الذرة ،وقد اجريت التجارب في مركز التكنولوجيا بولاية كنساس للمقارنة بين الطرق المختلفة من حيث الدقة وزمن التقدير وسهولة الاجراء ودرجة الامان والعوامل الاخرى المؤثرة في دقة التقدير ،وقد ثبت من التجارب كفاءة طريقة Aflatestفي مقابل الطرق الأخرى Radioimmunoassay, ISA , Hplcوبناء على ذلك استطاعت شركة

-١٥٠-

ملوثات العلف

VICAMمن التعاقد مع هيئة الاغذية على توريد الاجهزة الخاصة بتقدير

الافلاتوكسينات.

التقدير الكمى للميكوتوكسينات :

نظ ار لان الميكروتوكسينات نواتج طبيعية لفطريات العفن فان التحكم فيها يتوقف على مدى الدقة في تقدير كميتها في العينات المأخوذة للتحليل ،ويمكن توجيه الاعلاف المصابة الى استخدامات اخرى مناسبة طبقا لمدى تركيز هذه

المركبات فيها.

وتنحصر الطرق التقليدية لتقدير الميكوتوكسينات على استخلاص طويل يتبعه استخدام الكروماتوجراف ذات الطبقة الرقيقة اوباستخدام كروماتوجراف سائل ذات ضغط عالي ،وهذه الطرق حساسة الا انها طويلة الزمن ومكلفة بالإضافة الى

تعقيدات خطواتها.

وقد ظهرت بعض الطرق الحديثة البسيطة والتي لا تستغرق سوى ٣٠دقيقة فقط والتي تناسب الكثير من التطبيقات ،ومن هذه الطرق ما استحدثه نظام VICAMوالذي يتميز عن غيره من النظم الاخرى بما يلى :

-١يستغرق التقدير بهذا النظام مدة ١٠دقائق بعد الحصول على العينة

المطحونة.

-٢يتطلب هذا التقدير استخدام كحول ميثايل فقط كمذيب بينما تحتاج الانظمة الاخرى الى العديد من المذيبات المكلفة والتي منها ما هو سام ويصعب

التخلص من آثاره

-٣لا يحتاج عامود الفصل الى الثلاجة ويصلح لمدة عام على عكس الانظمة

الأخرى.

-٤يعطى هذا النظام النتائج في صورة جزء في المليون بينما تعطى الانظمة الاخرى النتائج في صورة وحدات امتصاص للضوء والتي تحتاج الى كمبيوتر

لتحويلها الى جزء في البليون.

-١٥١-

البيئة وملوثات العلف

-٥لا يحتاج هذا النظام الى محلول قياسى في كل مجموعة عينات على

عكس الانظمة الاخرى.

-٦يحتاج هذا النظام الى ماصات ذات حجم ١سم ٣مما يسهل العمل ويقلل

من الاخطاء.

-٧رخص ثمن عامود الفصل والكيماويات المستخدمة.

طريقة Aflatest Method

-١ضع ٥جم من العينة المطحونة في خلاط صغير واضف اليها ٥جم من ملح

الطعام.

-٢أضف ١٠٠سم ٣من محلول الاستخلاص ) %٨٠كجول ميثيل %٢٠ +ماء

مقطر(.

-٣غط الخلاط واخلط جيدا على سرعة عالية ولمدة دقيقة واحدة.

-٤رشح على ورقة ترشيح واستقبل فقط ٢٥-٢٠سم ٣في دورق نظيف.

-٥ضع ١٠سم ٣من المستخلص الراشح في كأس نظيف واضف اليه ٤٠سم ٣ماء

مقطر.

-٦رشح ثم اجمع الراشح في كأس نظيف.

-٧جهز عامود الفصل الخاص بعد توصيله الى مضخة.

-٨صب على عامود الفصل ١٠سم ٣من الراشح.

-٩اغسل عامود الفصل بحجم ١٠سم ٣من الماء المقطر ،وتعاد هذه الخطوة ثانية.

-١٠أضف ١سم ٣من كحول الميثيل الى عامود الفصل واستقبل الراشح في

كيوفيت نظيفة

-١١أضف ١سم ٣من محلول Aflatest TMالمظهر )المجهز طازجا يوميا( الى

الكيوقيت واخلطها جيدا.

-١٢ضع الكيوفيت في جهاز الفلوروميتر وسجل القراءة بعد ٦٠ثانية في صورة

-١٥٢-

ملوثات العلف

جزء في البليون.

ملحوظة

فى حالة التقدير على عينة من اللبن تتبع الخطوات التالية:

-١أضف ١جم ملح طعام الى ٥٠سم ٣من اللبن السائل واخلطهما جيدا.

-٢ضعها في جهاز الطرد المركزى على سرعة ٢٠٠٠دورة لمدة ١٠دقائق.

-٣بواسطة محقن يمكن الحصول على الدهن الراسب في القاع ثم رشحهما

خلال فلترGlass micro fiber

-٤اتبع الخطوات العالمية.

طريقة Zearala test method

-١ضع ٥٠جراما من العينة المطحونة في خلاط صغير واضف اليها ٥جم من

ملح الطعام.

-٢أضف ١٠٠سم ٣من محلول الاستخلاص ) %٨٠كحول ميثيل %٢٠ +ماء

مقطر(

-٣غط الخلاط واخلط جيدا على سرعة عالية ولمدة دقيقة واحدة.

-٤رشح على ورقة ترشيح واستقبل فقط ٢٥-٢٠سم ٣في دورق نظيف.

-٥ضع ١سم ٣من الراشح في دورق نظيف واضف اليه ٤٩سم ٣ماء مقطر.

-٦رشح ثم اجمع الراشح في كأس نظيف.

-٧جهز عامود الفصل الخاص بعد توصيله الى مضخة.

-٨صب على عامود الفصل حجم ١سم ٣من الراشح إذا كان محتوى المادة -٢٥

١٠٠جزء في المليون نقطة كل ثانية.

-٩او حجم ١٠سم ٣إذا كان محتوى المادة ١٠-٠,٢جزء في المليون.

-١٠صب على عامود الفصل ٥سم ٣ماء مقطر ،ثم كررها ثانية لغسل العامود.

-١٥٣-

البيئة وملوثات العلف

-١١ضع أسفل العامود كيوفيت نظيفة.

-١٢أضف ١سم ٣كحول ميثايل نقى على العامود ،ثم استقبل الراشح في الكيوفيت.

-١٣أضف الى الكيوفيت ١سم ٣من المحلول المظهر.

-١٤ضع الكيوفيت في الجهاز وسجل القراءة بعد مرور ١٢٠ثانية وتظهر القراءة

في صورة جزء في المليون.

ملحوظة:

المحلول المطهر Developexيوجد في صورة عبوات تحتوي على ٢.٥جم من مادة صلبة Aluminium – chloride hexahydrateتكفي لعمل ٥٠عينة.

ويضاف ٥٠سم ٣من كحول الميثايل على المادة في الزجاجة وتترك لمدة ساعة على الاقل مع الرج المناسب ،ويجب التأكد من ذوبان كل المادة الصلبة ،وقبل الاستخدام مباشرة يجب رج الزجاجة جيدا ،ويراعى غلقها جيدا لمنع تطاير كحول

الميثايل.

اما محلول الاستخلاص Extraction solutionفيتكون من:

200 ml , 800 ml Methenaol

طريقة Ochratest method

H2O

-١ضع ٥٠جم من العينة المطحونة في خلاط صغير واضف اليها ٥جم من

ملح الطعام.

-٢أضف ١٠٠سم ٣من محلول الاستخلاص ) %٨٠كحول ميثيل(.

-٣غط الخلاط وأخلط جيدا على سرعة عالية ولمدة دقيقة واحدة.

-٤رشح على ورقة ترشيح واستقبل فقط ٢٥-٢٠سم ٣في دورق نظيف.

-٥ضع ١٠سم ٣من الراشح في دورق نظيف واضف اليه ٤٠سم ٣ماء مقطر ملحوظة) :فى حالة الشعير استخلص المادة بدون اضافة ملح الطعام(.

-٦رشح ثم اجمع الراشح في كأس نظيف.

-٧جهز عامود الفصل الخاص بعد توصيلة الى مضخة.

-١٥٤-

ملوثات العلف

-٨صبه على عامود الفصل حجم ١٠سم ٣من الراشح فقط كل ثانية.

-٩صب على عامود الفصل ١٠سم من محلول الغسيل.

-١٠أضف ١٠سم ٣ماء مقطر لغسيل العامود.

-١١ضع أسفل العامود كيوفيت نظيفة.

-١٢أضف ١.٥سم ٣من محلول الاستخلاص الخاص ،واستقبله في الكيوفيت.

-١٣ضع الكيوفيت في جهاز الفلوروميتر وسجل القراءة في صورة جزء في

البليون بعد ٦٠ثانية.

ملحوظة:

محلول الغسيل Washing solutionيتكون من:

20 1 ml Water, Nacl 11 ml, NaHCo3 Tween –59

ويتكون محلول eluting solutionمن:

100 ml Water, NaOH4 g

طريقة Fumonitest method

-١ضع ٥٠جم من العينة المطحونة في خلاط صغير واضف اليه ٥جم ملح

الطعام.

-٢أضف ١٠٠سم ٣من محلول الاستخلاص ) %٨٠كحول ميثايل %٢٠ +ماء

مقطر(.

-٣غط الخلاط واخلط جيدا على سرعة عالية ولمدة دقيقة واحدة.

-٤رشح على ورق ترشيح واستقبل فقط ٢٥-٢٠سم ٣في دورق نظيف.

-٥ضع ٥سم ٣من الراشح في كأس نظيف واضف اليه ٢٠سم ٣من محلول منظم Mycotoxim wash Salt 25g , Bicarbonate 5g, Tween 0.1 ml,

H2O 1L

-٦رشح ثم اجمع الراشح في كأس نظيف ويجب ان يكون الراشح نقيا.

-٧جهز عامود الفصل الخاص بعد توصيله الى مضخة.

-١٥٥-

البيئة وملوثات العلف

-٨صب على عامود الفصل حجم ١٠سم ٣من الراشح بمعدل نقطة كل ثانية.

-٩الغسيل الأول :صب على العامود ١٠سم ٣من المحلول المنظم نقطة كل ثانية

ثم كررها ثانية.

-١٠الغسيل الثانى :صب ١٠سم ٣من الماء المقطر على العامود.

-١١ضع أسفل العامود كيوفيت نظيفة.

-١٢أضف ١سم ٣من كحول ميثايل نقى على العامود واستقبل الراشح في

الكيوفيت.

-١٣أضف 1⁄2 سم ٣من المحلول المظهر Aالى الكيوفيت.

-١٤أضف 1⁄2 سم ٣من المحلول المظهر Bالى الكيوفيت )إذا تحول لونه الى

الاصفر استخدم محلول آخر طازجا(.

-١٥ضع الكيوفيت في جهاز الفلوروميتر وسجل القراءة بعد ٥دقائق في صورة

جزء في المليون.

بعض التعليمات الهامة عند تقدير الافلاتوكسينات بهذا النظام:

-١استخدم دائما ادوات جيدة ونظيفة جدا ومحاليل من درجة عالية من كحول

الميثايل والماء المقطر.

-٢يجب اختبار المحاليل على جهاز الفلوروميتر والتي يجب ان تعطى قراءة

صفر.

-٣اتبع التعليمات بدقة متناهية للحصول على نتائج دقيقة.

-٤تأكد من خلو الانابيب من فقاعات الهواء قبل الاستعمال.

-٥يجب ان يكون معدل المرور في عامود الفصل بطيئا ومستم ار ) ٢-١نقطة في

الثانية الواحدة(.

-٦يحضر المحلول المظهر طازجا يوميا ولا يستخدم الا بعد مرور ٨ساعات من

-١٥٦-

ملوثات العلف

تحضيره.

-٧استخدم كيوفيت نظيفة وتحاشى أي تلوث للمحلول فيها.

-٨تأكد من شفافية الراشح قبل وضعه في عمود الفصل ويجب وضع الراشح على

العامود فور ترشيحة مباشرة.

-٩تأكد من سلامة عمل جهاز الفلوروميتر.

-١٠ضع في الكيوفيت ١سم ٣من الراشح ثم أضف اليه مباشرة ١سم ٣من المحلول المظهر وامزجهما معا جيدا ثم ضعها مباشرة في الجهاز.

-١١استخدم فقط الادوات الخاصة ب ،VICAMواحذر ملامسة المحاليل مع

المطاط او البلاستيك لعدم تلويث المحاليل.

بالإضافة الى ذلك طريقة اخرى مبنية على اساس قياس انتاج غاز ثانى اكسيد الكربون Carbon dioxide productionحيث انه عند نمو الفطريات ينتج Carbondioxideغاز ثانى اكسيد الكربون ،ويقاس تأثير المادة الحافظة او مثبط الفطربات على نمو الفطريات بقياس انتاج غاز ثانى اكسيد الكربون ويتم ذلك بوضع المادة المعاملة مع الكونترول في زجاجة محكمة على درجة ح اررة الغرفة ويقاس غاز ثانى اكسيد الكربون بجهاز Gaschromatogoraphic detectionبمرور الوقت، وبمرور وقت اطول لانتاج غاز ثانى اكسيد الكربون للوصول الى معدل انتاج الغاز أكثر من ٧/٧) %١٠و (10 vol %نشاط عالي وتأثير حيوى كبير للمادة الحافظة المثبطة للفطريات Antimicrobial activity of the preservative product.

-١٥٧-