البيئة وملوثات الأعلاف

البيئة وملوثات العلف

تأثير Mold – Nilعلى انتاج غاز ثانى اكسيد الكربون:

المعاملة

عدد الساعات اللازمة للوصول الى حجم أكبر من

٧/٧و%١٠

%٠.٢امونيوم بوبيونات

٢٤٠

كونترول

١٢٠

Competitive mixture %0.1

٢١٦

Mold stop MI%0.1

٣١٢

الطرق الحديثة لتقدير الافلاتوكسينات:

ونتيجة للفعل السئ للأفلاتوكسينات B1والذي تفرزه فطريات اسبرجلاس فلافوس واسبرجلاس باراز تيكس والتي تنمو على المنتجات الزراعية وتسبب امراض السرطان ونقص المناعة في الإنسان نتيجة تناوله مباشرة في الأغذية فيجب تقليل تواجده في الأغذية الى اقل الحدود ،وبالتالي يجب اتباع طرق دقيقة لتقديره وذلك ضمن برامج الأمان الحيوى في الأغذية ،الى اقل الحدود ،وبالتالي يجب اتباع طرق دقيقة لتقديره وذلك ضمن برامج الامان الحيوى في الاغذية ،ويلاحظ ان الطرق المعروفة من TLCو ELCو HPLCطرق يمكنها الكشف عن أي محتوى من افلاتوكسين B1الا انها تحتاج الى ادوات غالية الثمن ،وفى هذا الصدد فلابد من ايجاد طرق رخيصة وموثوق فيها ،ومثال ذلك طريقة ELISAوالتي اوجدها لأول مرة Chu and Vena 1977والتي تصل حساسيتها الى . 0.5 ml/ng ٢ – ٠,٢ وأيضا طريقة dot ELISAوفيها تم اتباع خطوة تحضين مسبقة لتصل الحساسية من 500 pgالى 1 pgوالتي قام بتطويرها Sekhon et al 1996

وفيما يلي تفصيل لهذه الطريقة.

ثم تبعه ) Leszczynska (2001بطريقة ELISAوتقدير الافلاتوكسينات

في المنتجات الغذائية.

-١٥٨-

ملوثات العلف

:وفيما يلى الطرق المذكورة بالتفصيل

:Sekhon et al (1996) طريقةChemicals:

AFB1-BSA, BSA. Freund`s adjuvant-incomplete. Complete (CFA, IFA). Diamino benzidine dihydochride (DAB) and ophenylene diamine dihydrochioride (OPD) were produced from Sigma Chemical Co., St. Louis. USA. Goat, anti-rabbit 1gs-HRP was

procurred from Daropats, Demmark.

Production of antibodies:

Antibodies against AFB1 were raised in rabbits by immunization with sub-cutaneous injection of 400 μg of AFB1-BSA. Followed by an intramuscular booster (400 μg) after 15 days and freed from antiBSA antibodies in the same manner described by Kapur et al (1996).

Competitive inhabition ElISA for AFB1 detection:

Qualitative detection of AFB1 by competitive inhibition dot-ELISA was carried out as per. In step 3(a) antiserum and stabdard AFB1 were preincubated for 1 h before being allowed to react with soild phase bound AFB1. for quantitation. Plate-ELISA was performed as per. With a few modifications i.e. optimum antigen concentration (obtained in checkerboard titration) used eas 1 μg/well and the

substrate used was OPD, instead of DAB.

Finally ELISA was tested for the performance in sera samples of poultry birds for AFB1 detetion. For this purpose, 50 chicken sera samples obtained from the department of Veterinary Pathology, from the brids fed on a normal diet and diet supplemented with 1.25 ppm of standard AFB1 were screened both by plate- and dot-ELISA.

:Leszczynska (2001) طريقةAflatoxins were determined in food products avaliable in retait outlets. Aflatoxins were extract from food samples with amethanolwater mixture (7:3 or 4:1) and solvents such as chloromethane or

heptane.

The aflatoxins-total test included the following compenents a 96-well plate coated with plate coated with antibodies to mouse antibodies: stabdard solutions of aflatoxin B1 in methanol with

-١٥٩-

البيئة وملوثات العلف

concentrations .05, 1.5, 4.5, 13.5 and 10.5 μg per cm3. a conjugate of peroxidase and aflatoxin B1: a solution of monoclonal mouse antibodies to aflatoxine a substrate:urea peroxide:a chromogen:

tetramthylbenzidine: a reagent for process termination:sulphurie acid (1mol/dm2):a buffer for dilution (PBS 0.1 mol/dm3. pH 7.4).

Total aflatoxin content:

About 2 g of a disintegrated samples was weighed to ±0.0001 g and extracted with 10ml of methanol-water mixture (7+3) to separate aflatoxin. To that end. The rest was homogenised for 10 min at room temperature and then the resulant deposit was centrifuged. An aliqout (100 μl) of the supernatant was diluted with 600 μl of phospate buffer at pH= 7.2 An aliquout of this solution (50 μl) or standard soultion (50 μl). 50 μl of the aflatoxine-peroxidase conjugate and 50 μl of the mouse antibody solution against aflatoxin were added to each well of the used plate. The determination was repeated three times. The samples were incubated for 30 min at room tempetature in the darkness. The free and peroxidase-combined aflatoxins compete for the combining site with antibodies to mouse antibodies immobilised on the plate. Next. The plate was emptied and washed five times with phosphate buffer at pH=7.2 then. 50 μI of tettramethylbenzidine and 50 μI of urea peroxide were added and incbated again for 30 min in darkness. The reaction was terminated by adding 100 μI of the stop reagent. The absorbance of solution was measured at a wavelength of 450 nm. Using an ELISA rteading apparatus. The content of aflatoxins was calcultaed using the

pereviously prepared standard curve.

Aflatoxine B1 content about 2 g of sample weight to ±0.0001 g was extracted and homogenised simulaneously for 10 min in a homogeniser with 6 ml of methanol water mixture (4 + 1) and

contrifugred (10 min at 3500 rpm).

An aliquot (100 μl) of the supermatant was dituted with 70 μl of phosphate buffer and the resltant solution was used for

determinations.

An aliquot (100 μl) of the examined sample solution or the standard solution and 50 μl of the aflatoxin-peroxidase conjugate solution were added to each plate well the rest was stirred and

-١٦٠-

ملوثات العلف

inclubated at room temperature for 1 h. Next, the wells were emptied and washed five times with..3 mol/1 phospgate buffer (pH = 7.2).

Then 150 μl of the chromogen (tetramethylbenzidine)-substrate (urea peroxide) mixture was added to each well and the whole solution was incubated at room temperature for 30 min in darkness. Once the reaction was terminated by adding the stop reagent. The absorbance was measured at the wavelength of 450 nm by using the ELISA reading apperatus. The aflatoxin B1 content was calculted from the

reference curve.

Aflatoxin M1: the tested samples (5 ml) of milk were cooled to 10°C and centrifuged (10 min at 3500 rpm) to separate fat. To weighed chese samples (2.0000±0.0001 g). 40 ml of dichloromethane was added and they were extracted for 2 min by means of a homogeniser. After filtration, the oily residue was dissolved in 0.5 ml of methanol and..5 ml of phosphate buffer at pH= 7.3 and then. 1 ml of heptane was added. Next. The deposit was centrifiuged for 15 min at 3500 rpm and 15°C.after removing the heptane layer. 100 μl of the methane phase was mixed with 400 μl of phosphate buffer to obtain a solution sample for the adetermination of aflatoxin M,. an aliquot (100 μl) of the tested sample solution or the standard solution was added to each well of 96 well plate coated with antibodies to aflatoxin M, and incubated for 60 min at a room temperature. Once the plate was emptied and waqshed five times.

100 μl of the aflatoxin M1 – peroxidase conjugate solution was added and the whole solution was inclubated for 60 min at room temperature. The plates were washed five times and then 50 μl of the substrate and 50 μl of the chromogen were added. After 30 min of incubation at a room temperature. The reaction was terminated and the absorbance of solution was measured by means of the ELISA reading apparatus at the wavelength of 450 nm. The incubation process was carried out in darkness. The aflatoxin M1 content was

-١٦١-

البيئة وملوثات العلف

calculated from the standerd curve. The stages of the complete determination of aflatoxin M1 are the same as those of aflatoxin B1.

إستراتيجيات التغلب على مشاكل الأفلاتوكسينات:

تعتبر الأفلاتوكسينات من ملوثات الاعلاف والاغذية التي لا يمكن تجنبها حتى مع استعمال طرق تصنيعية جيدة ،وقد قامت هيئة الاغذية الامريكية بوضع جداول تشير الى الحدود المسموح بتواجدها في الاغذية لكل من الانسان والحيوان والتي تصل الى c.PPbافلاتوكسينات كلية بينما في اللبن . 5 ppb M10ويلاحظ صعوبة الوصول الى تقدير %١٠٠لكل كمية الافلاتوكسين وبالتالي فانه طالما لا يمكن تجنب الافلاتوكسينات فيجب اتباع بعض الاستراتيجيات لابطال الفعل السام لها ،وتشمل هذه الاستراتيجيات الطرق الطبيعية للفصل والمعاملات الح اررية والاشعاع والاستخلاص بالمذيبات او الادمصاص من المحاليل بالإضافة الى المعاملات الميكروبية والتخمر كما تستخدم طرق كيماوية لابطال والتخلص من

سمية الافلاتوكسينات.

الإستراتيجية الأولى:

وفيها يتم التفاعل مع باى سلفيت صوديوم والمعاملة بالامونيا .وباستخدام الأمونيا يتم تكسير حلقة لاكتون وتحويل B1الى عدة مركبات اخرى تتميز بسميه اقل كثي ار .اما باستخدام ابى سلفيت صويدوم فتتفاعل مع M1 , G1 , B1وتحولها

الى مركبات قابلة للذوبان ويتم التخلص منها.

الإستراتيجية الثانية:

ويتم فيها تقليل سمية الافلاتوكسينات وذلك باستعمال مركبات غذائية )ومنها البروتين والدهن الغذائى والفيتامينات والعناصر المعدنية الصغرى( او باستخدام الاضافات الغذائية )المضادات الحيوية والمواد الحافظة( وغيرها من المركبات

-١٦٢-

ملوثات العلف

الغذائية والتي تتداخل في كل التأثيرات السامة بالافلاتوكسينات داخل جسم الحيوان.

الإستراتيجية الثالثة:

تق وم ه ذه الاس تراتيجية عل ى تقلي ل المم تص م ن الافلاتوك سينات م ن القن اة اله ضمية وذل ك باض افة م واد غي ر ع ضوية تعم ل عل ى الارتب اط بالافلاتوك سينات وتع رف مث ل ه ذه الم واد بالمركب ات الكيماوي ة المرتبك ة مث ل اض افة مرك ب ص وديوم كال سيوم الومني وم وس ليكات المائي ة ) (HSCASال ى علائ ق الحي وان وال ذي ي رتبط ب شدة م ع الافلاتوك سينات ويقل ل حركته ا عل ى طول القناة الهضمية مما يقلل كثي ار من الممتص من الافلاتوكسينات.

إقتصاديات الأفلاتوكسينات:

تتسبب النظريات وما تفرزه من الافلاتوكسينات السامة في الكثير من الاضرار المالية البالغة وتتمثل هذه التكاليف الباهظة في الاضرار الناجمة عن الخسائر في المحاصيل الزراعية المصابة وكذلك الخسائر الناجمة من نفوق الحيوانات وقلة انتاجها مع انخفاض كفاءة التحويل الغذائى ،هذا بالإضافة الى تكاليف اتباع الاستراتيجيات المختلفة للتقليل من التأثير السام لمثل هذه الافلاتوكسينات ،وايضا تتمثل هذه التكاليف في الخسائر البشرية الناجمة عن الاصابة بامراض السرطان ونقص المناعة الطبيعية وغيرها من الامراض الناتجة عن تناول الانسان بهذه

الافلاتوكسينات في الاغذية.

المواصفات الدولية والحدود المسموح بها للافلاتوكسينات في مواد العلف:

تعتبر الافلاتوكسينات هي أكثر السموم الفطرية التي اهتم العالم بوضع قوانين لمراقبتها وتحديد دورها ،وقد تم وضع الحد الاقصى المسموح به في كل من مواد العلف المختلفة حتى لاتسبب ضر ار عند تناولها على الاسس التالية:

-لا تؤثر على صحة الحيوان وانتاجة.

-١٦٣-

البيئة وملوثات العلف

الا تصل الى غذاء الانسان من خلال الانتاج الحيوانى.وقد بدأت هذه القوانين عام ١٩٧٦وبعد ذلك دخلت في تشريعات دول السوق الاوروبية المشتركة ،كذلك فقد اعدت العديد من الدول المواصفات الخاصة بها مثل الولايات المتحدة الامريكية ودول اسيا وبعض الدول الاوروبية الاخرى مثل السويد.

وقد ناقشت لجنة المواصفات الدولية Codexالحدود المسموح بها في عدد اجتماعات كان آخر اجتماع لجنة ال Codexالمنعقدة ببانكوك عام ١٩٨٧ والخاصة بالسموم الفطرية ،تم اجتماع لجنة ال Codexالمنعقدة في هولندا عام ١٩٨٨والخاصة بملوثات الاغذية ومن ضمنها الافلاتوكسينات ،وذلك لحماية الانسان والحيوان وتسهيل التعامل بين دول العالم المختلفة في المعاملات التجارية.

ويوضح الجدول ) (١٧-٢الحدود المسموح بها من الافلاتوكسينات في مواد العلف

المختلفة.

جدول ) (١٧-٢الحدود المسموح بها من الأفلاتوكسينات في مواد العلف

الحبوب والبذور الزيتية

مواد الاعلاف المباشرة نباتية او حيوانية يمكن تغذيتها

للحيوان مباشرة

علف متكامل للحبوب

)اعلاف حيوانات اللبن والعجول والضأن(

علف متكامل للدواجن والخنزير )فيما عدا الحيوانات

الصغيرة(

اعلاف متكاملة اخرى

مخلوط اعلاف غير متكاملة للمجترات )فيما عدا حيوان

اللبن والعجول والضأن(

مخلوط اعلاف غير متكاملة للدواجن

الفول السودانى – بذرة القطن – الذرة

١٥ميكروجرام كجم من كل

الافلاتوكسينات

B1, B2, G1, G2

فى غذاء الانسان

٥٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

٥٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

٢٠ميكروجرام لكل جم )(B1

١٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

٥٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

٣٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

٢٠٠ميكروجرام لكل كجم )(B1

-١٦٤-

ملوثات العلف

وقد اوضح الكتاب الصادر عن الهيئة المصرية للتوحيد القياسى الحدود القصوى للسموم الفطرية )الميكوتوكسينات( في الاغذية وذكر ان الافلاتوكسينات هي السموم الناتجة من انواع معينة من فطر الاسبراجلس ويتواجد الفطر في جميع انحاء العالم ولكن انتاج السموم يتوقف على درجة الح اررة والرطوبة وكذلك البيئة

الغذائية التي ينمو عليها الفطر.

ويوجد القليل من دول العالم التي تنص قوانينها على شرط خلو جميع الاغذية تماما من الافلاتوكسينات ،اما باقى الدول فيتراوح الحد المسموح بوجودة في الاغذية والاعلاف طبقا لمدى مستواها الاقتصادى ووعيها العلمى والصحى والاجتماعى.

وفى مصر لوحظ ان الاغذية والاعلاف تخضع لاشراف ثلاث جهات مختلفة وهي و ازرة الصحة التي تنفذ القانون رقم ١٠لسنة ،١٩٦٦و ازرة الزراعة التي تنفذ القانون رقم ٥٥٤لسنة ١٩٨٤بالإضافة الى هيئة التوحيد القياسى التي تنفذ القانون رقم ٣لسنة ١٩٥٧مما يؤدى الى اختلاف المقاييس المستند عليها عند فحص

العينة الواحدة.

ويلاحظ عدم اشتمال هذه القوانين لجميع انواع السموم وعدم التعرض لجميع انواع الاغذية والاعلاف مما يشكل صعوبة كبيرة عند تحليل العينات ولذلك فمن الضروري وضع امانة تحليل ومتابعة الكشف على المواد الغذائية والاعلاف في مسئولية هيئة واحدة لضمان عدم التضارب في النتائج والاحكام.

طرق معاملة مواد العلف الملوثة بالسموم الفطرية:

وعموما يجب تقليل تركيز هذه المركبات في مواد العلف حتى لا تنتقل الى الالبان والبيض واللحوم الناتجة منها الى الحد الذي يمنع حدوث تسمم للحيوانات ونفوقها وبالتالي يسبب خسائر اقتصادية جسيمة ،ويمكن اختلاف هذه التركيزات باختلاف الحيوانات وايضا باختلاف عمر هذه الحيوانات.

وقد أمكن تقليل تأثير هذه المركبات خاصة اذا كانت بتركيزات منخفضة

-١٦٥-

البيئة وملوثات العلف

بعمليات مختلفة مثل الغربلة والطحن والتحميض والتجميد والتجفيف ،وما يتبقى بعد ذلك يكون ذات تأثير ضار ايضا بسبب الفعل التراكمى لمثل هذه المركبات في الجسم ،وبالتالي فمن المستحسن منع التلوث الفطرى للأغذية اساسا وذلك بتحسين طرق جمع المحصول ونقله وتخزينه .والغرض من مثل هذه المعاملات قتل

الفطريات او تثبيط وايقاف نموها.

أولا :المعاملات الطبيعية:

-١تحسين ظروف تخزين العلف بخفض درجة الح ار ةر والرطوبة مع التهوية الجيدة.

-٢اجراء عملية التسخين الى درجات ح ار ةر مختلفة ولمدد زمنية تتوقف على نوع الفطر ونوع

مادة العلف المصابة وعلى درجة الرطوبة فيها.

-٣تعريض العلف المصاب لأشعة الشمس مباشره.

-٤تعريض العلف المصاب للمعاملة بالاشعاع.

-٥التعقيم في الاتوكلاف.

-٦فصل الحبوب المصابة ميكانيكيا عن باقى الحبوب السليمة.

ثانيا :المعاملات الكيماوية:

-١المعاملة بهيدروكسيد الصوديوم والفورمالدهيد.

-٢المعاملة بهيدروكسيد الكالسيوم والفورمالدهيد.

-٣استخدام المركبات المحتوية على عناصر الباريوم والكادميوم بمعدل جزء في

المليون لكل ١كيلو جرام من العلف.

-٤لا ينصح باستخدام المبيدات الحشرية اومبيدات الحشائش نظ ار للخطورة الناجمة

عنها على الحيوان.

-٥استخدام مضادات الفطر بالتركيزات المسموح بها لكل نوع على حدة.

مضادات الفطريات Antifungal agents

يجب مقاومة نمو الفطريات النامية على مواد العلف اثناء نموها وقبل ان تنتشر

-١٦٦-

ملوثات العلف

اعدادها وتتمكن من كل العلف وتبدأ في افراز سمومها ،وقد أمكن تصنيع مركبات كيماوية تستخدم كمضادات للفطريات وتعمل اما على قتل الفطر بمجرد اللمس او العمل على ايقاف او تثبيط نمو الفطريات وبالتالي حماية العلف من اخطار الفطر ،وقد اجازت قوانين الاغذية استخدام مثل هذه المضادات وحددت النسب المسموح بها ومنها

-١مولد بان Mold Ban

يتكون كيماويا من حمض البروبيونك بنسبة Verxite granulas ،%٥٠ بنسبة ،%٣٠بنتوفيت بنسبة %٢٠ويستخدم بمعدل ٢-١رطلا من المضاد لكل

طن من العلف.

-٢مولد بان بلوس Mold Ban Plus

ويتكون هذا المضاد من حمض البروبيونيك بنسبة Verxite ،%٥٠ granilesبنسبة Cobb frations،%٢٥بنسبة %٢٥ويضاف الى العليقة

بمعدل ٢-١رطلا لكل طن من العلف.

-٣التك Altic

يتكون هذا المضاد من حمض الفورميك بنسبة ،%١٥حمض البروبيونك بنسبة Vermiculite ،%٤٥بنسبة Mono propylene glucol ،%٣٨بنسبة

،%٢ويضاف بمعدل ١رطلا لكل طن من العلف.

-٤كيم سان السائل Kim San

ويتكون هذا المضاد السائل من حمض البروبيونك بنسبة ،%١٠حمض الخليط بنسبة ،%١حمض اللاكتيك بنسبة ،%١حمض اسكوربيك ،%١ جلسريدات احادية وثنائية بنسبة ،%٢الماء بنسبة %٨٥ويضاف بمعدل ٨-٤

سم ٣لكل لتر ماء شرب.

Fungitec -٥

حيث يستخدم للقضاء على الفطريات والعفن او جراثيمها في حظائر الحيوانات

-١٦٧-